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稳定细胞系构建亲和层析技术的分离纯化策略

 1 Protein A
  稳定细胞系构建层析介质的发展历史单抗作为同一类分子有其类似的分子结构,这是使用平台技术作为分离纯化的基础。例如:含有Fc片段的全抗体或Fc融合蛋白可以使用Protein A层析介质作为捕获步骤。
  单抗药物的剂量为几毫克-几百毫克。由于单抗要求的剂量较大,如:Rituximab 400mg/m2,Humira 40mg/剂;所以单抗药物的产品质量要求极高。杂质的残留量极低,例如:HCP<100ppm,DNA<10pg/剂, Protein A<10ppm,聚体<1%。Protein A捕获步骤主要去除的杂质:大部分HCP,DNA;由于 ProteinA层析介质对聚体没有去除作用,所以在此捕获步骤中尽量减少聚体的形成,某些Protein A层析介质在纯化中会产生聚体,这样的protein
  A介质尽量避免使用。在此捕获步骤中会有Protein A(配基)的脱落。在Protein A捕获过程中,培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基Protein A,因此样品收集液中会有Protein A的片段;以及ProteinA与介质骨架的偶联方式不稳定,这些都是protein A的脱落原因。所以选择Protein A脱落较低的层析介质是非常关键的。
  2 用于捕获抗体的Protein A层析介质的选择
  现在商业化Protein A的层析介质较多,对于不同的项目选择方法如下:
  A. Fc融合蛋白:一般Fc融合蛋白的DBC低于单抗。这是Fc融合蛋白的空间位阻效应大于单抗。对于Fc融合蛋白MabSelectXtra高动态载量的重组protein A介质是比较好的选择;
  B. FC融合蛋白:如果Fc融合蛋白的稳定性差,由其在低pH缓冲液中,可以选择MabSelect Sure。由于只有FC区域的结合,所以洗脱时的所用的pH稍高;
  C. 高表达量:随着细胞培养技术的改进,抗体的表达水平不断提高,对于高表达量的项目可以选择Mabselect Sure LX。通常的载量在60g/L以上;
  D. 不同可变区的类型在Protein A层析介质的DBC也不同,一般VH3 > VH 1>VH2>VH4;
  E. 修饰后的ProteinA 如:Mabselect Sure 对Fab没有亲和作用,此类介质不能用于抗体的结构域VH;
  F. Fab,ScFv可以按照分子的结构中轻链类型选择Capto L,或LambdaFabSelect。
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